Eindrapportage

30 oktober 2019 10:16

Korte samenvatting onderzoek  

Hypertrofische cardiomyopathie (HCM) is een verkregen hartaandoening die wordt gekenmerkt door overmatige groei van hartspiercellen in met name de linker kamer van het hart. HCM is de meest voorkomende hartziekte bij de kat. Geschat wordt dat 10-20 % van alle katten een vorm van HCM heeft. Binnen bepaalde rassen, zoals de Maine Coone en de Ragdoll komt de ziekte mogelijk nog vaker voor. HCM bij de kat is een erfelijke ziekte en wordt verondersteld, gelijk als in de mens, dominant over te erven.

De meest gebruikelijke manier om HCM te diagnosticeren bij een kat is het vaststellen van een verdikte wand van linker kamer door middel van echocardiografisch onderzoek. Het grootste nadeel van deze methode is de lage negatief voorspellende waarde van een echocardiogram waarbij geen afwijkingen worden gevonden. Het is namelijk niet uit te sluiten dat een kat op een later tijdstip alsnog HCM ontwikkelt. Gevolg is dat de later herkende lijders mogelijk al ingezet zijn in fokprogramma`s. Een betere methode zou een genetische test zijn. Momenteel worden drie verschillende testen van ras-specifieke (Maine Coone (n=2) en Ragdoll (n=1)) mutaties aangeboden. Helaas is gebleken dat de aanwezigheid van deze mutaties HCM niet verklaren. Uit recent eigen onderzoek is gebleken dat we de mutaties vaker zagen bij oudere Maine Coones met een normale hartspier dan bij katten met een verdikte hartspier.

De fokkerij zou zeer gebaat zijn bij een vroege herkenning van lijders. Alleen op deze manier kan de prevalentie van deze desastreuze aandoening teruggebracht worden. 

De resultaten...

Whole genome sequencing

Op basis van eerdere genotypering en fenotypering waren we in staat een twaalftal Maine Coones te selecteren die lijder waren voor HCM, maar waar geen van de ras-specifieke mutaties aanwezig waren. Deze DNA samples zijn opgewerkt en naar Hartwig Medical Foundation gestuurd. De volledige DNA volgorde is in januari geanalyseerd en in kleine fragmenten beschikbaar gekomen.

Bioinformatica

Het Utrecht Bioinformatics Expertise Core heeft deze data fragmenten aan elkaar geplakt en vergeleken met het beschikbare referentie genoom. In vergelijking met het referentie genoom van de kat zijn er in onze HCM katten ruim 28 miljoen veranderingen/verschillen gevonden. Dit komt overeen met eens in de duizend bouwstenen een verandering wat zeer vergelijkbaar is met andere organismen. 28 miljoen verschillen is een hele grote lijst. Veel van deze verschillen zitten gelukkig in stukken DNA die niet vertaald worden naar eiwit. Van het DNA wordt 1-2% uiteindelijk vertaald naar eiwit. Deze sequenties zijn over het algemeen ook minder variabel. Zelfs als we alleen kijken naar DNA varianten in eiwit-coderende gebieden, dan nog steeds blijft het een indrukwekkend grote lijst.

Tijdens de loop van dit project is een publicatie uitgebracht die het onderzoek van genetische panels voor myopathien bij humaan beschrijft. Hieruit bleek dat slechts een 11-tal genen een functionele mutatie kunnen bevatten. Andere beschreven mutaties hebben geen functioneel effect. Ik heb mij in eerste instantie gericht op deze 11 genen. Deze lijst is nog iets verder uitgebreid met genen wanneer deze een soortgelijke functie hebben en een mutatie bevatten die een groot effect hebben en in een substantieel deel van de katten terug gevonden is. De uiteindelijk lijst bestaat uit 15 mutaties verdeeld over de genen JPH2, TNNT2, MYBPC3, MYO1B en MYO1D. 

Validatie

De gevonden mutaties zijn in eerste instantie geverifieerd in de gebruikte cases. Ook een techniek als WGS kan wel eens wat fouten maken, zeker als het uitgangsmateriaal van onvoldoende kwaliteit is. De varianten bleken betrouwbaar te zijn. In een tweede stap heb ik gekeken of deze varianten ook voorkomen in de 24 goed gefenotypeerde controles. Ziekte veroorzakende mutaties moeten veel minder of niet voorkomen in deze groep ten opzichte van de gebruikte zieke katten. In geval van de twee varianten in JPH2 werd duidelijk dat beide met gelijksoortige frequentie voorkomen en dus is dit gen waarschijnlijk niet betrokken bij HCM in de Maine Coone. Van de drie varianten in TNNT2 is er een uitgesloten, de laatste twee wordt nog aan gewerkt. In MYBPC3, het gen waar al mutaties in gevonden zijn bij Maine Coons, zitten nog 8 potentiele mutaties. 3 daarvan zijn uitgesloten op basis van de controles, 1 moet nog beter uitgewerkt worden. Een viertal mutaties zouden mogelijk nog een rol kunnen spelen in HCM. Deze mutaties komen ook voor in een aantal gezonde katten. Na navragen bleken deze katten al te zijn geëuthanaseerd om ongerelateerde problemen. Gezien de oude leeftijd en het niet detecteren van HCM lijken ook deze varianten in MYBPC3 niet relevant voor de Maine Coone.

 

De laatste hoop is gevestigd op MYO1B en MYO1D. Hiervoor moet de genotypering nog geoptimaliseerd worden. Deze genotypering zal in september afgerond worden.

 

Afronding project

Na de genotypering in september weten we of we over kunnen gaan op publiceren.

Voor publicatie zijn er de mogelijkheden om voor een veterinair blad te gaan, waardoor we wereldwijd op veterinair gebied het grootste bereik hebben, of voor een meer humaan blad waarin de kat als model gezien kan worden. Dit verhoogd de wetenschappelijke waarde en de kans om toekomstige verdere financiering te ontvangen. De gevalideerde mutatie(s) zullen aangeboden worden als DNA test via ons Expertise Centrum Genetica van Gezelschapsdieren.

Wanneer de uiteindelijke resultaten niet voldoende zijn voor een publicatie zullen we de resultaten van de commercieel aangeboden DNA testen communiceren naar de Maine Coone vereniging. Het feit dat binnen de fokkerij deze mutatie als leidend gezien wordt, maar er geen enkele indicatie is dat dit een valide test is voor de Nederlandse populatie, betekend dat keuzes momenteel berust zijn om verkeerde informatie. Beter zou het zijn als we samen kunnen kijken of we middels registratie van de patiënten een beeld kunnen krijgen van de populatie. 

Proces 

De eerste fase van het project en de experimentele stappen hierna zijn volgens plan verlopen. Ondanks de noviteit van het verkrijgen van whole genome data van katten is het gelukt deze data te analyseren. De resultaten leveren nog niet een simpel antwoord op, maar dit heeft te maken met de complexiteit van de genetische achtergrond van het ziektebeeld, in plaats van met technische uitdagingen. Of we de causale mutatie zo makkelijk boven water gaan krijgen is helaas nog maar de vraag. Als er in deze genen geen duidelijke mutatie zit, dan zullen we onze zoektocht uitbreiden naar genen die niet bekend zijn met HCM en wordt de studie gericht op het vinden van onbekende genen. Wetenschappelijk is dit een zeer spannende en enerverende studie omdat resultaten wellicht weer wat van de ‘genetische puzzel’ bij zowel dierlijke als humane patiënten kunnen verhelderen – en daarmee ook een geweldig voorbeeld van hoe (bijna) elk (degelijk) wetenschappelijk onderzoek een stap is naar meer kennis over dier en mens.

Uiteraard zal een dergelijke studie ook ingewikkelder en minder snel af te ronden zijn, waardoor de fokkerij minder snel de resultaten om zou kunnen zetten naar een praktische toepassing in het veld.

Maatschappelijke relevantie

Daarnaast zijn de eerste resultaten ook binnen het humane veld enthousiast ontvangen. Met grote interesse wachten zij op de uitgewerkte data. Mede door dit onderzoek begint men de kat te zien als een klinisch model voor niet opgeloste humane patiënten. Om de classificatie van HCM te verbeteren en een beeld te krijgen van de frequentie van deze hartkwaal in de algemene katpopulatie zijn we daarnaast begonnen met het verzamelen van hartweefsel van overleden katten. Dit zijn katten die veelal in de spoedkliniek geëuthanaseerd zijn om wat voor reden dan ook. Met toestemming van de eigenaar verzamelen we het hart en slaan we dat op. Dit onderzoek vindt plaats in samenwerking met het UMCU en de VUmc/AMC. Zij hebben heel ervaring met zowel humaan HCM als de fysiologische veranderingen bij muismodellen en hebben daarnaast de nodige middelen om hiermee te helpen. Dit betekent dat de oorspronkelijke onderzoeksvraag steeds maar breder – en maatschappelijk relevanter wordt : we richten ons nu op het ophelderen van het ziekteproces bij zowel katten als humane hartpatiënten, zonder een van beide groepen te kort te doen.